病毒学检验一整理笔记

• 病毒学检验的特点
• 病毒学检验的内容和应用范围

一般原则

• 满足硬件设施和生物安全要求
• 标本的采集原则 做好采样规划，保护病毒，标记样品，运送正确
• 质量控制原则

主要内容

• 直接检测
• 血清学/免疫学诊断
• 病毒的分离培养
• 定量检测 滴度测定，病毒核酸载量测定
• 病毒的纯化，浓缩和保存

应用范围

• 病毒感染和病毒性疾病的诊断

• 动物传染源和节肢动物的检测

• 新发病毒性疾病的病原和防治研究

• 病毒性传染病的检验与检疫

• 病毒性人兽共患病的检疫

• 新发传染病病毒检测的特点

• 选择用于病毒培养的细胞遵循的原则

细胞选择原则

• 细胞对病毒的敏感性（易感）

• 根据不同研究目的的选择细胞株或系

• 了解病毒在不同细胞培养中增殖特征

• 选择培养方法:静止培养，旋转培养，悬浮培养

• 常见细胞污染的来源，种类及防控措施

选择无菌动物或无特定病原体动物的组织 严格无菌操作以及规范的接种操作 选择无特定病原体动物作为血清的提供者 加入抗生素 未污染的细胞注意冷冻保存，定期测定其是否存在感染

措施 预防

来源 组织, 血清和消化液, 操作, 空气, 器材

● 细胞培养技术在病毒学检验中的应用

细胞病变检查法:细胞圆缩, 细胞聚合, 细胞融形成合胞体 (特征性包涵体)

病毒的分离培养和鉴定 病毒鉴定方法 子主题 2 ● 病毒纯化:纯化过程保持生物学性质和感染性

空斑试验 死亡细胞不能形成中性红燃料出现不染色的空斑

病毒定量检测 50%终点法测定病毒滴度

药物体外抗病毒试验

肿瘤病毒致癌机制研究

第二章 ● 鸡胚接种途径，以新城疫病毒接种为例，请说明接种方法好过程 ● 血凝和血凝抑制试验的原理，如何判断结果 ● 动物实验遵循的原则 ● 鸡胚和动物实验的主要用途 ● 实验动物按微生物控制分类的目的，如何分类

第五章 ● 电子显微镜技术在病毒鉴定方面的优势

快速负染技术 简单, 负染技术操作简单。 准确:电镜检测的结果主要是发现病毒颗粒的存在是证明病毒存在的最直接证据, 对具有明显形态特征的病毒即刻可做出准确的判断。 具有同时检测多种病原的潜力，依赖于已知的核酸序列抗原或抗体信息。

• 对病毒进行检测的常规电子显微镜技术 负染技术，超薄切片制样技术，免疫电子显微镜技术
• 负染样本制作过程病毒灭活的方法 负染色是一种反衬染色，通过重金属盐溶液染色，增加标本外围密度，在生物标本的

外围形成均质的电子不透明环境，而电子能够通过主要由碳，氢氧氮等元素组成的密度较低的生物样本。形成电子透亮的白色，而时生物标本，显示出负的（较透明的）反差，成像后的效果为在黑色背景下低密度的标本（病毒颗粒）呈现白色透亮状态，从而形成负染色成像。 优点。大大提高了标本的反差和分辨力，既能够清晰显示出病毒的超微结构。简便易行，不要求高纯度的标本制备技术技通常不需要对样本进行纯化，有杂质也不会影响

对病毒形态 8 的辨别。染色技术本身不改变生物样本的活性剂，不因染色造成病毒形态的改变。

第六章

• 流感病毒和腺病毒的核酸检测方法的异同
• 鼻咽拭子是呼吸道病毒检测常用的标本，采集此类标本是注意事项。除鼻咽拭子之外，呼吸道病毒感染检测还可以采集哪些标本
• 举例说明常见呼吸道感染病毒分离培养时使用的敏感细胞系
• 肠道病毒和引起肠胃炎的腹泻病毒通常包括哪些，其病毒学地位分别是什么，其基因组特征分别是什么？
• 肠道病毒和腹泻病毒的区别是什么？

肠道病毒 EV 是小 RNA 病毒科肠道病毒属，包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可病毒，新型肠道病毒。可感染人或动物，在宿主消化道中复制增殖，表现为隐性感染

腹泻病毒包括轮状病毒，诺如病毒，札如病毒，星状病毒，肠道腺病毒，可引起急性肠胃炎。

• 可用于检测肠道病毒和腹泻病毒的标本有哪些。

肠道病毒：感染急性期从病变部位或具有临床症状部位采集的相应标本：如疱疹液，脑脊液，心包积液，粪便标本，咽拭子标本，其他。

腹泻病毒为粪便

• 轮状病毒有几种抗原，其分型是如何确定的？

• 病毒性腹泻的临床诊断标准和实验室诊断标准分别是什么？

诺如病毒实验室检测：固相免疫电镜将病毒进行抗原分型，分子生物学，RT-PCR 测定病毒的基因组

第八章

• 皮肤和粘膜病毒是指哪一类，其种类和引起的临床表现类型有哪些？

双链 DNA，痘病毒，疱疹病毒，乳头瘤病毒

• 皮肤和粘膜病毒感染可采集的样本类型由哪些由哪些采集方法？

1. 抗 -HBe 一般存在于无症状 HBV 携带者及活动期慢性肝炎患者中。

2. 抗 -HBs ： 是 HBsAg 刺激机体产生的特异性中和抗体，是保护性抗体。阳性表明机体已经产生免疫力

3. 抗 -HBc ： 包括抗 -HBclgM 、抗 -HbcIgG ，前者是急性感染的重要指标，也是慢性活动肝炎的重要标志。阳性主要见于乙肝恢复期，慢性感染和既往感染。
   ● 简述各型肝炎病毒的传播途径。 ● 简述 Dane 颗粒的结构。 大球形颗粒。乙肝血清中，为具有感染性的完整的 HBV 病毒，有双层衣壳，外衣壳由双层脂质和蛋白质组成，HBsAg 及 S1 前抗原和前 S2 抗原既镶嵌在此脂质双层中。 ● 试述各型肝炎病毒的实验室诊断标准。

   第十二章

   • 常见虫媒传染病及其病原体，重要虫媒传染病有哪些临床症状 黄热病：黄热病毒，蚊传播 登革热：登革热病毒，伊蚊 森林脑炎：蜱，蜱传脑炎病毒，中枢神经系统病变 基孔肯雅热：基孔肯雅热病毒，伊蚊，发热、皮疹、剧烈关节疼痛
   • 虫媒病毒的实验室检测方法，各有什么优缺点 直接检测法，血清诊断法，病毒分离和鉴定
   • 虫媒病毒的主要传播途径及防控措施 控制传染源：患者隔离 切断传播途径：防蚊，灭蚊，防蜱，灭蜱 保护易感人群：提高人群免疫力，知识宣教，疫苗接种 加强国境卫生检疫，严防疾病输入

   HIV 的实验室检测项目和方法

   直接检测病毒

   • 抗原检测 血清p24抗原阴性（血清转换），早期筛查
   • 核酸检测 定性，定量（用拷贝数或国际单位表示病毒载量）
   • 病毒分离培养

   检测抗体

   • 抗体筛查试验 酶联免疫吸附，化学发光或免疫荧光试验
   • 抗体确证试验 免疫印迹试验：测HIV抗体蛋白 (B4,B7,B17)

   病毒分离与培养 恒河猴，出现细胞病变小于（CPE）

   免疫缺陷试验检查 CD4+和CD8+T淋巴

4. 形体微小,能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。

5. 无细胞结构,其主要成分是核酸和蛋白质

6. 每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA 或 DNA）

7. 因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸

8. 病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒

9. 为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性

10. 在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力

11. 有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中,并能诱发潜伏感染
    体外细胞培养的基本条件:

12. 条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要

13. 避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素.

14. 体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、

15. 酸碱度（能耐受的 ph 范围为 6.6-7.8,依靠缓冲系统调节），

16. 气体条件（细胞生长需要 CO₂,大规模培养需要有足够的氧气）、

17. 温度(最适温度为 35—37° C）、

18. 水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、

19. 无菌条件等
    实验动物的微生物控制分类:

20. 普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原

21. 清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变

22. 无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染

23. 无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体
    实验动物的遗传学分类

24. 近交系，指经过连续 20 代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系

25. 封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体

26. 突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物

27. 杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代

28. 转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物
    大鼠、小鼠的采血方法

29. 剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约 5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血 0.1ml，大鼠约 0.4ml

30. 眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧，使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入,切开静脉丛，血流即流入取血管。

1. 拓展练习

50%终点法是通过什么方式确定病毒的终点稀释度？

A. 将病毒悬浮液在实验室中培养，通过显微镜观察细胞病变情况，记录造成50%鸡胚病变的终点稀释度。 B. 将病毒悬浮液直接注射到兔子体内，观察其致死量并确定终点稀释度。 C. 将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至老鼠和狗，找出造成50%老鼠和狗死亡的终点稀释度。 D. 将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞,将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成 50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。

答案：D

2. 拓展练习

间接计数在病毒检验过程中的用途是什么？

A. 判定细菌感染性的定性方法 B. 判定寄生虫感染性的定性方法 C. 判定真菌感染性的定量方法 D. 判定病毒感染性的定量方法

答案：D

3. 拓展练习

阮病毒引起的疾病的潜伏期特点是什么？

A. 疾病潜伏期长 B. 疾病潜伏期为一个月 C. 疾病潜伏期为一年 D. 疾病潜伏期短

答案：A

4. 拓展练习

核酸探针是用来做什么的？

A. 以治疗和预防为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段 B. 以研究和诊断为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段 C. 以研究和生产为目的，带有标记物的未知序列的核酸片段 D. 以教育和培训为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段

答案：B

5. 拓展练习

细胞培养技术是哪一种类型的体外培养方法？

A. 是对完整器官进行的体外培养方法 B. 是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法 C. 是对由组织分散成的多个不同种类细胞进行的体外培养方法 D. 是对单一类型细菌进行的体外培养方法

答案：B

6. 拓展练习

流感病毒包膜上的 NA 是什么类型的蛋白？

A. 糖蛋白刺突 B. 核酸蛋白刺突 C. 碳水化合物蛋白刺突 D. 脂质蛋白刺突

答案：A

7. 拓展练习

人乳头瘤病毒（HPV）只能感染人的哪些细胞？

A. 神经细胞 B. 肌肉细胞 C. 血液细胞 D. 皮肤和黏膜上皮细胞

答案：D

8. 拓展练习

PFUs试验是通过什么与平铺于平板表面的宿主细胞混合来测定动物病毒的感染单位？

A. 不同稀释倍数的动物病毒 B. 不同种类的细菌 C. 不同数量的植物病毒 D. 不同浓度的人类病毒

答案：A

9. 拓展练习

引物在聚合酶的作用下，以什么端点作为起点进行DNA链的延伸？

A. 2′ 端 B. 4′ 端 C. 3′ 端 D. 5′ 端

答案：C

10. 拓展练习

PFUs试验是通过什么与平铺于平板表面的宿主细胞混合进行的？

A. 相同稀释倍数的人类病毒 B. 不同浓度的细菌培养液 C. 不同稀释倍数的动物病毒 D. 不同种类的植物病毒

答案：C

11. 拓展练习

近交系是指经过连续多少代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系？

A. 15 代以上 B. 18 代以上 C. 30 代以上 D. 20 代以上

答案：D

12. 拓展练习

HBeAg阳性可以作为什么的辅助诊断？

A. 丁型肝炎 B. 慢性乙肝 C. 急性乙肝 D. 丙型肝炎

答案：C

13. 拓展练习

利用酶将不同来源的 DNA 分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的 DNA 重组子后，下一步是什么？

A. 导入离心机 B. 导入宿主细胞 C. 导入试管 D. 导入培养皿

答案：B

14. 拓展练习

血凝试验中，病毒和红细胞结合形成什么形状？

A. 块状 B. 链状 C. 网状 D. 球状

答案：C

15. 拓展练习

50%终点法是通过什么方式来确定病毒的终点稀释度？

A. 将病毒悬浮液接种至培养皿中的细菌，通过观察细菌生长情况来确定病毒的终点稀释度。 B. 将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 C. 将病毒悬浮液在体外进行化学反应，根据反应结果计算出造成50%动物死亡或病变的终点稀释度。 D. 将病毒悬浮液直接注入动物体内，观察其存活情况，确定病毒的终点稀释度。

答案：B

16. 拓展练习

轮状病毒属于哪个科？

A. 哺乳动物病毒科 B. 呼肠病毒科 C. 鸟类病毒科 D. 双链 RNA 病毒科

答案：B

17. 拓展练习

对于潜伏期多少天以上的病毒感染，可以检测特异性IgM抗体作为早期感染的指标？

A. 14天以上 B. 5天以上 C. 10天以上 D. 7天以上

答案：C